Udostępnij znajomym!

Nanotechnologia, czyli zastosowanie/wytwarzanie materiałów o rozmiarach nanometrycznych jest prężenie rozwijającą się technologią we współczesnym świecie. Zastosowania obejmują różne dziedziny życia codziennego, np. kosmetyki (kremy, maseczki), budownictwo (farby), elektroenergetykę (nanoprzewodniki), przemysł spożywczy (opakowania) czy odzieżowy (ubrania dla sportowców). Szczególne znaczenie ma użycie nanocząstek w medycynie, np. w onkologii. Zastosowanie nanomateriałów może przynieść ogromne korzyści dla pacjentów. Przeprowadzając substancję aktywną w rozmiar nano zmieniamy jej właściwości fizykochemiczne, a co za tym idzie możemy poprawić efekt terapeutyczny. Nanoleki w porównaniu do swoich klasycznych odpowiedników mogą przyczyniać się do poprawy rozpuszczalności leków trudnorozpuszczalnych w wodzie, a więc poprawić ich wchłanialność i biodystrybucję. Poprzez zmianę kształtu oraz rozmiaru cząsteczki możemy poprawić jej celowanie i przenikanie do komórek, polepszyć przenikanie przez bariery fizjologiczne, a także zmniejszyć toksyczność. Nie zawsze zmiana formy cząsteczki na nano jest korzystna, dlatego bardzo ważne jest, aby w pełni scharakteryzować otrzymaną strukturę.

Podstawowym parametrem charakteryzującym nanomateriały jest wielkość ich cząstek oraz rozkład tej wielkości. Obecnie istnieje kilka dobrze poznanych metod pozwalających na przeprowadzenie takiej charakterystyki. Najpopularniejszymi są: analiza śledzenia nanocząstek (NTA), dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) oraz skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM).

Zarówno metoda analizy śledzenia nanocząstek jak i dynamicznego rozpraszania światła wykorzystują ruchy Browna do pomiaru wielkości nanocząstek. W metodzie DLS światło lasera pada na zdyspergowane w roztworze cząstki. Pomiar polega na zarejestrowaniu przez detektor światła rozproszonego. Ważnym parametrem jest temperatura próbki, która jest mierzona poprzez wbudowany termometr (szybkość poruszania nanocząstek zależy od temperatury). Oprogramowanie za pomocą równania Stokesa-Einsteina przelicza szybkość poruszania się cząstek na ich wielkość. Do analizatora DLS dostarczone są materiały odniesienia (nanocząstki o określonej wielkości) w celu kontroli jakości pomiaru. Metoda DLS jest jedną z najczęściej wykorzystywanych metod w laboratoriach. Pozwala na bardzo precyzyjny pomiar wielkości cząstek monodyspersyjnych w szerokim zakresie (0,3–10 µm). Ważną zaletą jest to, iż analizatory DLS pozwalają na pomiar próbek w szerokim zakresie stężeń. Na uwagę zasługuje również fakt, iż pomiar możliwy jest w dowolnym medium dysperygującym. Jest to bardzo ważne, gdyż właściwości nanomateriałów zależą między innymi od pH i siły jonowej, dlatego możliwość wykonania badania w konkretnym środowisku pozwala uzyskać wiarygodne wyniki. Przygotowanie próbki jest bardzo proste (rozpuszczenie nanacząstek w odpowiednim medium lub pobranie próbki do badań z danego etapu procesu) a pojedynczy pomiar trwa maksymalnie 5 minut, co pozwala uzyskać wyniki w danym punkcie czasowym procesu technologicznego. Mimo wielu zalet technika DLS ma poważne ograniczenia. Jednym z nich jest to, iż metoda zakłada, że mierzone cząstki mają rozmiar kulisty. Metoda podaje zafałszowane wyniki dla próbek o innych kształtach. Kolejnym poważnym ograniczeniem jest fakt, iż metoda nie nadaje się do pomiaru próbek polidyspersyjnych. Wynik otrzymujemy w postaci średniej, a obecność nawet niewielkiej ilości cząstek o większych rozmiarach zawyża wynik. Tym samym metoda jest wrażliwa na obecność agregatów czy zanieczyszczeń w próbce. Ograniczenie to można swobodnie wykorzystać do badania stabilności nanocząstek jako zaletę metody.

Metoda śledzenia nanocząstek (NTA) jest świetnym uzupełnieniem DLS. Pomiar polega na oświetleniu roztworu nanocząstek światłem lasera o określonej długości fali. Światło zostaje rozproszone, a jego rozbłyski rejestrowane są przez kamerę umieszczoną w mikroskopie. Analizę wykonujemy zgodnie z instrukcja dołączoną do aparatu. Do analizatora są dostarczone materiały odniesienia (nanocząstki o określonej wielkości) w celu kontroli jakości pomiaru. Najważniejszą zaletą metody jest dokładność pomiaru zarówno dla próbek monodyspersyjnych jak i polidyspersyjnych. Za pomocą tej metody możemy badać nie tylko rozmiar nanocząstek, ale także rozkład wielkości. Idealnie nadaje się dla próbek rzeczywistych, mających zdolność do agregacji a także próbek, w których obecne są zanieczyszczenia. Metoda NTA nie jest jednak idealna. Podstawową wadą jest czas pomiaru. Pomiar może trwać od kilku minut nawet do godziny. Wynika to z faktu, iż metoda jest wrażliwa na stężenie nanocząstek w roztworze. Dobór optymalnego stężenia zajmuje większość czasu pomiaru. Wykonanie pomiaru w określonym punkcie czasowym jest bardzo często niemożliwe. Zakres detekcji jest dużo mniejszy (10-2000 nm). Nie bez znaczenia jest również doświadczenie operatora. Wynik uzależniony jest od ustawienia parametrów pomiarowych przez osobę wykonującą badanie.

Przykładem aparatu wykorzystującego technikę NTA jest NanoSight LM10 firmy Malvern:

Każdy pomiar należy zacząć od odpowiedniego przygotowania celi pomiarowej. Czyszczenie celi polega na pozbyciu się nie tylko poprzedniej próbki, ale również na wypolerowaniu powierzchni oraz usunięciu drobnych cząstek stałych, np. pyłków kurzu, które zakłócają pomiar. Jest to czynność dosyć czasochłonna, ale bardzo ważna w celu wykonania prawidłowego pomiaru.

Cela pomiarowa analizatora NanoSight LM10 firmy Malvern

Tak przygotowaną celę pomiarową należy wypełnić roztworem próbki, podłączyć zewnętrzny termometr (szybkość poruszania nanocząstek zależy od temperatury) i rozpocząć pomiar. W zależności od rodzaju próbki roztwór do badania można przefiltrować (np. przez sączek strzykawkowy). Nieodłącznym elementem analizatora jest komputer z oprogramowaniem NanoSight NTA 3.2, za pomocą którego zbieramy dane oraz je interpretujemy. Za pomocą kamery umieszczonej w mikroskopie oraz ruchomego stolika wybieramy miejsce pomiarowe, które jest ściśle określone. Pomiar polega na zarejestrowaniu filmików w określonym czasie (zazwyczaj 60 sekund) z określoną ilością powtórzeń dla danej próbki z różnych miejsc pomiarowych (miejsce pomiarowe jest zmieniane za pomocą przepychania tego samego roztworu strzykawką). Warto tutaj zaznaczyć, iż delikatne drgania przenoszone np. przez podłogę wpływają negatywnie na pomiar. Analizator powinien stać na specjalnym kamiennym stole. Po zarejestrowaniu filmików oprogramowanie przechodzi do analizy danych. Kluczowym momentem jest dobór odpowiednich parametrów detekcji przez operatora. Od ustawionej wartości parametru „Detection Threshold” zależy rozmiar nonocząstek, które są brane pod uwagę podczas zliczania, dlatego doświadczenie operatora jest bardzo ważne. Wygenerowany raport (również w postaci 3D) możemy eksportować do pliku pdf:

Raport NTA

Za pomocą analizatora uzyskujemy wynik nie tylko w postaci rozmiaru nanocząstek, ale także rozkładu wielkości i ich stężenia w roztworze. Do głównej wady urządzenia można zaliczyć konstrukcję stolika mikroskopu. Podczas przepychania roztworu przez celę pomiarową nawet przy dużej ostrożności bardzo łatwo jest miejsce pomiarowe. W innych urządzeniach (np. NS300 Malvern) stolik mikroskopu jest nieruchomy, przez co stabilny oraz dodatkowo miejsce pomiaru jest znaczone, co znacznie upraszcza i skraca czas pomiaru.

Najbardziej dokładną, również szeroko rozpowszechniona metodą pomiaru rozmiaru nanomateriałów jest skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM). Poza rozmiarem metoda dostarcza nam informacji również o kształcie materiału i topografii powierzchni.

Zasada pomiaru jest bardzo prosta. Analizowana próbka jest bombardowana wiązką elektronów, które ulegają interakcji z analizowanym nanomateriałem. Pomiar wykonywany jest w warunkach wysokiej próżni. Detekcja polega na pomiarze sygnału pochodzącego od elektronów wtórnych. Aby uzyskać miarodajny wynik, należy wykonać bardzo dużo skanów z różnych miejsc próbki. Mimo ogromnych możliwości metoda ma swoje ograniczenia. Wynikają one głównie z wymagań dotyczących przygotowania próbki. Materiał poddany SEM musi być przede wszystkim pozbawiony śladów wilgoci, np. poprzez suszenie czy wyparcie wody cieczami jonowymi. Pozbycie się wody często wiąże się ze zmianą właściwości nanomateriałów, np. ich odkształceniem. Rozwiązaniem tego problemu może być niskotemperaturowa metoda SEM (cryo-SEM). Przygotowanie próbki polega na jej zamrożeniu, przez co struktura analizowanych materiałów nie ulega zmianie. Otrzymujemy obraz z gorszą rozdzielczością, ale zalety znacznie przeważają nad wadami metody.

Poza opisanymi metodami istnieje jeszcze wiele innych służących do zbadania rozmiaru nanomateriałów, np.: transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), mikroskopia sił atomowych (AFM) czy izoterma Brunauera, Emmetta i Tellera. Prawidłowa charakterystyka nanocząstek stanowi wyzwanie. Wynika to z faktu, iż właściwości nanomateriałów zależą od bardzo wielu czynników, w tym od warunków przeprowadzenia badania, np. medium dyspergującego, odporności na działanie temperatury i wysokiej próżni, obecność wody i jej braku a także siły jonowej i pH. Optymalizacja metody (mimo prostej obsługi aparatów) jest często bardzo trudna.

Literatura:

Lin P. C.; Lin S.; Wang P. C.; Sridhar R., Biotechnology Adv., 2014, 32, 711–726

Cho E. J.; Holback H.; Liu K. C.; Abouelmagd S. A.; Park J.; Yoon Yeo Y., Pharmaceutics, 2013, 10, 2093−2110

Uskokovic V., Journal of Dispersion Science and Technology, 2012, 33, 1762–1786

Filipe V.; Hawe A.; Jiskoot W., Pharmaceutical Research, 2010, 27(5), 796–810

Stabentheiner E.; Zankel A.; Pölt P., Protoplasma, 2010, 246, 89–99

 

Joanna Pietras

 

 

 

 

Komentarze

Twój adres email nie zostanie opublikowany.